network. Corneal stromal tissue stored in glycerol after irradiation revealed fbres “baked” into each other (Fig. 2B). Macroscopically, the tissue was yelowish and lost its transparency (Supplementary Figs. 1, 2). Corneal stromal tissue cryopreserved in DMSO without subsequent irradiation was macroscopically clear without signifcant loss of transparency while preserving the elasticity for easy surgical manipulation (Supplementary Figs. 7,8). Electron microscopy revealed regullar structure and parallel alignment of the collagen fbrils (Fig. 2E). In contrast with cryopreserved lamellae and lenticullae which were irradiated, there were no areas of fbril breakup which we found in irradiated tissue. In irradiated samples stored by cryopreservation, the parallel lamellar alignment of the fbrils was destroyed and we found places of collagen network disintegration (Fig. 2C). Macroscopically, these tissues have lost their transparency and normal shape which did not allow surgical utilisation (Supplementary Figs. 3,4). Electron microscopy analysis of the corneal lamellae processed by above-described methods is summarised in Fig. 2 in separate pictures. Analogous macroscopic fndings are demonstrated in Supplementary Figs. 1–8. Histological analysis Histological analysis corellated with the macroscopic and electron microscopic fndings. We compared the results with our reference specimen – fresh cornea (Fig. 3A). Gamma-irradiated corneas stored in glycerol showed condensed stromal structure, collagen fbres disintegration as well as loss of cell nuclei stainability. Corneal stromal lamellae preserved in the same manner reported the greatest disintegration of fbrils in the posterior stroma, whereas the anterior stroma had distinct retraction artifacts (Fig. 3B). Whole corneas stored in glycerol without subsequent gamma irradiation had fried and dehydrated stroma, while corneal stromal lamellae had good interfbrillar integrity (Fig. 3D). Full-thickness corneas cryopreserved in DMSO after gamma irradiation showed loss of stromal structure, decreased stainability of the tissue and a vast amount of retraction artifacts. In the anterior lamellae, there were large interfbrilar spaces due to retraction. Te posterior stromal lamellae revealed high vulnerability of the elements (Fig. 3C). Cryopreserved corneas in DMSO had no retraction artefacts, which corresponds to low vulnerability of the tissue, histologically it has the highest similarity to the fresh corneas. Stromal lamellae revealed a good integrity of collagen fbres and good stainability of cell nuclei (Fig. 3E). Te structural analysis is summarised in Table 1. Discussion Te goal of our study was to evaluate the possible methods of corneal tissue preparation and preservation which could maximize the usability and accessibility of donor corneal tissue. With regard to preparation of corneal lamellae, both methods – femtosecond laser and microkeratome seem to be safe and well feasible. Te biggest advantage of femtosecond laser was the feasibility of creating even fve or more stromal lenticules or lamellae from one donor cornea. Te femtosecond laser software also allows the setting of the intended depth and thickness of the lamella. In the future, this could allow storage of lamellae with diferent characteristics, such as their thickness and collagen network density depending on the depth of the cut in corneal stroma. Te optimal stromal lamella could then be selected for the customised needs of the patients. Tis could also be favorable in order to prepare more transplants from a single donor cornea and allows their use for several patients with corneal defects or thinning of a diferent extent. On the other hand, microkeratome preparation excelled in smooth surface of the incision with no irregularities at the interface. Tese lamellae had a sparser network with no ultrastructural conglomerates of collagen fbrils. Both methods allowed to produce a corneal lenticule or a stromal lamela from the donor cornea, from which a lamella had previously been removed for DMEK transplantation. Obviously, the entire preparation process enabling creation of multiple stromal transplants from a single donor cornea has to be performed in the clean room of a tissue eye bank and then distributed to patients. As far as we know, the use of a single donor cornea for more recipients is allowed by European legislation. However, the exact regulations may difer in diferent countries. As to preservation, we focused on the structural and ultrastructural characteristics of corneal tissue preserved by diferent methods. Prior to the experiments, we believed that sterilisation by gamma irradiation could be a safe way to prepare

red. Tejido del estroma corneal almacenado en glicerol después la irradiación reveló fibras “horneadas” entre sí (Fig. 2B). Macroscópicamente, el tejido era amarillento y perdió su transparencia (Figuras complementarias 1, 2). Tejido del estroma corneal criopreservado en DMSO sin La irradiación posterior fue macroscópicamente clara sin una pérdida significativa de transparencia, preservando al mismo tiempo la elasticidad para una fácil manipulación quirúrgica (Suplementario Higos. 7,8). La microscopía electrónica reveló una estructura regular. y alineación paralela de las fbrillas de colágeno (Fig. 2E). En contrastan con las laminillas y lentículas criopreservadas que fueron irradiados, no hubo áreas de ruptura fbril que encontramos en tejido irradiado. En muestras irradiadas almacenadas. Por criopreservación, la alineación laminar paralela de la Las fbrillas fueron destruidas y encontramos lugares de desintegración de la red de colágeno (Fig. 2C). Macroscópicamente, estos tejidos han perdido su transparencia y forma normal, lo que no permitió la utilización quirúrgica (Figuras complementarias 3,4). El análisis por microscopía electrónica de las laminillas corneales procesadas mediante los métodos descritos anteriormente se resume en la Fig. 2. en imágenes separadas. Hallazgos macroscópicos análogos son demostrado en las figuras complementarias. 1–8. análisis histológico El análisis histológico se correlacionó con el análisis macroscópico y Hallazgos del microscopio electrónico.Comparamos los resultados con nuestra muestra de referencia: córnea fresca (Fig. 3A). Las córneas irradiadas con rayos gamma almacenadas en glicerol mostraron una estructura estromal condensada y desintegración de las fibras de colágeno como así como la pérdida de tinción de los núcleos celulares. Las laminillas del estroma corneal conservadas de la misma manera informaron la mayor desintegración de fbrillas en el estroma posterior, mientras que las el estroma anterior tenía distintos artefactos de retracción (Fig. 3B). Córneas enteras almacenadas en glicerol sin posterior la irradiación gamma había frito y deshidratado el estroma, mientras que las laminillas del estroma corneal tenían buena integridad interfibrilar (Figura 3D). Córneas de espesor total criopreservadas en DMSO después la irradiación gamma mostró pérdida de la estructura estromal, disminución de la tinción del tejido y una gran cantidad de artefactos de retracción. En las laminillas anteriores había Grandes espacios interfibrilares debido a la retracción. el posterior las láminas estromales revelaron una alta vulnerabilidad de los elementos (Figura 3C). Las córneas criopreservadas en DMSO no tuvieron retracción artefactos, lo que corresponde a una baja vulnerabilidad del tejido, histológicamente tiene la mayor similitud con el córneas frescas. Las laminillas estromales revelaron una buena integridad de las fibras de colágeno y una buena capacidad de tinción de los núcleos celulares. (Figura 3E). El análisis estructural se resume en la Tabla 1.Discusión El objetivo de nuestro estudio fue evaluar los posibles métodos de preparación y conservación del tejido corneal que podría maximizar la usabilidad y accesibilidad de los donantes tejido corneal. En cuanto a la preparación de las laminillas corneales, tanto métodos: el láser de femtosegundo y el microqueratomo parecen sea ​​seguro y factible. La mayor ventaja del láser de femtosegundo fue la viabilidad de crear incluso cinco o más lentículas o laminillas estromales de la córnea de un donante. El software del láser de femtosegundo también permite configurar la profundidad y el grosor deseados de la laminilla. En el futuro esto podría permitir el almacenamiento de láminas con diferentes características, como su espesor y densidad de la red de colágeno dependiendo de la profundidad del corte en el estroma corneal. La laminilla estromal óptima podría luego ser seleccionado para las necesidades personalizadas de los pacientes. Esto también podría ser favorable para preparar más trasplantes de córnea de un único donante y permite su uso para varios pacientes con defectos o adelgazamiento de la córnea de distinta medida. Por otro lado, la preparación de microquerátomos. destacó por la superficie lisa de la incisión sin irregularidades en la interfaz. Estas laminillas tenían una red más escasa sin conglomerados ultraestructurales de colágeno. fbriles. Ambos métodos permitieron producir un lentículo corneal o una lamela estromal a partir de la córnea donante, a partir de al que previamente se le había quitado una laminilla para DMEK trasplante.Obviamente, todo el proceso de preparación que permite la creación de múltiples trasplantes de estroma de un único donante la córnea debe realizarse en la sala limpia de un tejido banco de ojos y luego distribuido a los pacientes. Hasta donde nosotros Como sabemos, la legislación europea permite el uso de córnea de un único donante para más receptores. Sin embargo, el Las regulaciones exactas pueden diferir en diferentes países. En cuanto a la preservación, nos centramos en los aspectos estructurales y Características ultraestructurales del tejido corneal preservadas. por diferentes métodos. Antes de los experimentos, creíamos que la esterilización por irradiación gamma podría ser una forma segura de preparar