each) at RT and postfxed for 2 h in aqueous 1% OsO4 at RT. Te postfxed samples were washed in copious amounts of redistilled water (3x, 20 min, each) and dehydrated in the graded ethanol series (25%, 50%, 75%, 90%, 96%, 100%, and 100%; 20 min each) at RT. Dehydrated samples in 100% ethanol were cooled to 4 °C and critical point dried (K850 Critical Point dryer, Quorum Technologies Ltd, East Sussex, United Kingdom). Dry specimens were mounted by high-purity conductive double-sided adhesive carbon tabs (EM-Tec CT12, 12 mm) onto standard 12 mm aluminum stubs (G301Z Pin stubs). Subsequently, they were coated with 3 nm platinum in a high-resolution sputter coater (Q150T SE, Quorum Technologies Ltd, East Sussex, United Kingdom). Te fnal samples were analysed in a FEG scanning electron microscope FEI Nova NanoSEM450 (FEI, Brno, Czech Republic) at 3 kV using SE, ETD, TLD, and CBS detectors (secondary electrons detectors and back-scattered electrons detectors). Te image acquisition was performed in 16-bit TIFFs with subsequent conversion to 8-bit TIFFs in the original FEI software. Te scans were analysed by two independent experts, a histologist and a pathologist, who described the morphological changes of the specimens in comparison to the reference fresh cornea. Histological analysis Te material was processed using a standard histological technique with formalin fxation and parafn embedding. Parrafn blocks were cut with a microtome, the preparations were stained with hematoxyline and eosin. All samples were then analysed by two independent experts, a histologist and a pathologist, who described the morphological changes of the specimens in comparison to the reference fresh cornea. Results Electron microscope and macroscopy Preparation technigues Te scanning electron microscopy confrmed that corneal stromal lamellae prepared by microkeratome had smoother cut-side surface than the ones prepared by femtosecond laser (Fig. 1A) Femtosecond laser preparation caused more irregularities on the interface (Fig. 1B,C). In histological images, we detected more conglomerates of the fbrils, while lamellae prepared by microkeratome had sparser network. Using femtosecond laser we were able to create more than fve lenticules from a single donor cornea, which were easy to manipulate by standard surgical procedures. Preservation methods Corneal stromal tissue stored in hypothermia at 4 °C in glycerol stayed macroscopically transparent with signs of dehydration (Supplementary Figs. 5,6). In electron microscopic analysis we detected cavitation bubbles between the collagen fbres, which correlated with the degree of dehydration. Tere were smaller aggregates of the fbrils, which were in bundles aligned in parallel (Fig. 2D). Te fbrils showed less signs of damage in comparison with gammairradiated tissue and the fbrils formed more re

cada uno) a temperatura ambiente y poscalentado durante 2 h en OsO4 acuoso al 1 %. en RT. Las muestras postfijadas se lavaron en grandes cantidades. de agua redestilada (3x, 20 min, cada una) y deshidratada en la serie de etanol clasificado (25%, 50%, 75%, 90%, 96%, 100% y 100%; 20 min cada uno) a temperatura ambiente. Muestras deshidratadas en etanol al 100% se enfriaron a 4 °C y el punto crítico secado (secador de punto crítico K850, Quorum Technologies Ltd, East Sussex, Reino Unido). Los especímenes secos fueron montado mediante lengüetas de carbono adhesivas de doble cara conductoras de alta pureza (EM-Tec CT12, 12 mm) sobre estándar Muñones de aluminio de 12 mm (muñones de pasador G301Z). Después, fueron recubiertos con platino de 3 nm en una alta resolución recubridor por pulverización catódica (Q150T SE, Quorum Technologies Ltd, Sussex Oriental, Reino Unido). Las muestras finales fueron analizado en un microscopio electrónico de barrido FEG FEI Nova NanoSEM450 (FEI, Brno, República Checa) a 3 kV utilizando detectores SE, ETD, TLD y CBS (detectores de electrones secundarios y detectores de electrones retrodispersados). La adquisición de imágenes se realizó en TIFF de 16 bits. con posterior conversión a TIFF de 8 bits en el original Software FEI. Las exploraciones fueron analizadas por dos expertos independientes, un histólogo y patólogo, quienes describieron los cambios morfológicos de los ejemplares en comparación con los córnea fresca de referencia.análisis histológico El material fue procesado utilizando un método histológico estándar. Técnica con fijación en formalina e inclusión en parafina. Los bloques de parafina se cortaron con un micrótomo y las preparaciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Luego, todas las muestras fueron analizadas por dos expertos independientes, un histólogo y patólogo, quienes describieron los cambios morfológicos de los ejemplares en comparación con los córnea fresca de referencia. Resultados Microscopía electrónica y macroscopía. Técnicas de preparación La microscopía electrónica de barrido confirmó que las laminillas del estroma corneal preparadas por microquerátomo tenían superficie del lado de corte más suave que las preparadas con láser de femtosegundo (Fig. 1A) Preparación con láser de femtosegundo causó más irregularidades en la interfaz (Fig. 1B, C). En las imágenes histológicas, detectamos más conglomerados de fbrillas, mientras que las laminillas preparadas por microquerátomo tenían una red más dispersa. Usando láser de femtosegundo podemos fueron capaces de crear más de cinco lentículas a partir de una sola córnea del donante, que era fácil de manipular mediante procedimientos quirúrgicos estándar. Métodos de conservación Tejido del estroma corneal almacenado en hipotermia a 4 °C en El glicerol permaneció macroscópicamente transparente con signos de deshidratación (Figs. complementarias 5,6). En el análisis de microscopía electrónica detectamos burbujas de cavitación entre los fibras de colágeno, que se correlacionaron con el grado de deshidratación.Había agregados más pequeños de las fbrillas, que estaban en haces alineados en paralelo (Fig. 2D). Las fbrillas mostró menos signos de daño en comparación con el tejido irradiado con rayos gamma y las fbrillas formaron más re