At the end of the experiments, we tested the possibility of creating multiple stromal lamellae from a single donor cornea by femtosecond laser. Te frst cut started at the depth of 100um and after the removal of the frst lamella with the thickness of 100um, we continued with deeper cuts of lamellae with the thickness of 100 um. Corneal tissue preservation All procedures, except for gamma irradiation, were performed under appropriate conditions at the Tissue Eye Bank (Department of Ophthalmology, University Hospital Královské Vinohrady and 3rd Faculty of Medicine in Prague). We compared fresh control corneas stored in Eusol-C © (Alchimia srl, Italy) at 4 °C to following groups: 1. corneal stromal tissue stored in hypothermia at 4 °C in glycerol (Glyo-on, Alchimia, Italy); n = 6, 2. gamma-irradiated corneal tissue (25 kGy, Bioster, Veverská Bitýška, Czech Republic) stored in glycerol; n = 6, 3. corneal stromal tissue cryopreserved in 10% DMSO (dimethylsulfoxide); n = 6, 4. gamma-irradiated corneal tissue (25 kGy, Bioster, Veverská Bítýška, Czech Republic) subsequently cryopreserved in 10% DMSO at -80 °C; n = 6. Half of the specimens from each group were analysed by histological and SEM (scanning electron microscope) analysis. Te images were assessed by two independent experienced histologists from the 1st and the 3rd Faculty of Medicine in Prague. FS laser versus microkeratome In the frst step, we decided to verify the diferences between the surface of the corneal stromal lamellae made by femtosecond laser and microkeratome. Te corneas which were not suitable for transplantation, stored in Eusol-C © at 4 °C, were cut into 10 lamellae in each group. Using the microkeratome Moria and FS laser (Ziemer femto LDV Z8) we created corneal lamellae in the diameter of 8 mm. Ten we stored them in Eusol-C © at 4 °C and transported them to morphological analysis. In order to avoid bias resulting from the intercorneal variations, we used both paired corneas from each donor, one was cut with microkeratome and the second one with femtosecond laser. Te samples were then analysed by two independent experienced histologists. SEM analysis (scanning electron microscope) We followed the standard tissue preparation protocol for scanning electron microscopy analysis. All samples were pre-washed in PBS (phosphate-bufered saline) bufer and fxed in 2.5% glutaraldehyde in PBS for 2 h at room temperature (RT) and overnight at 4 °C. Fixed samples were extensively washed with PBS bufer

Al Al final de los experimentos, probamos la posibilidad de crear múltiples laminillas estromales a partir de una córnea de un solo donante. mediante láser de femtosegundo. El primer corte comenzó en la profundidad. de 100um y tras la retirada de la primera laminilla con el espesor de 100um, continuamos con cortes más profundos de láminas con un espesor de 100 um. Preservación del tejido corneal Todos los procedimientos, excepto la irradiación gamma, se realizaron en condiciones apropiadas en el Tissue Eye Bank (Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario Královské Vinohrady y 3.ª Facultad de Medicina de Praga). Comparamos córneas de control frescas almacenadas en Eusol-C © (Alchimia srl, Italia) a 4 °C para los siguientes grupos: 1. tejido del estroma corneal almacenado en hipotermia a 4 °C en glicerol (Glyo-on, Alchimia, Italia); n = 6, 2. irradiado con gamma tejido corneal (25 kGy, Bioster, Veverská Bitýška, checo República) almacenado en glicerol; n = 6, 3. tejido del estroma corneal criopreservado en DMSO (dimetilsulfóxido) al 10%; n = 6, 4. tejido corneal irradiado con rayos gamma (25 kGy, Bioster, Veverská Bítýška, República Checa) posteriormente criopreservado en DMSO al 10% a -80 °C; n = 6. Se analizaron la mitad de los ejemplares de cada grupo. por histológico y SEM (microscopio electrónico de barrido) análisis.Las imágenes fueron evaluadas por dos independientes. Histólogos experimentados de la 1.ª y 3.ª facultad. de Medicina de Praga. Láser FS versus microqueratomo En el primer paso decidimos verificar las diferencias. entre la superficie de las laminillas del estroma corneal Realizado mediante láser de femtosegundo y microqueratomo. Las córneas que no eran aptas para el trasplante, almacenadas en Eusol-C © a 4 °C, se cortaron en 10 laminillas en cada una grupo. Utilizando el microqueratomo Moria y láser FS (Ziemer femto LDV Z8) creamos laminillas corneales en el diámetro de 8 mm. Diez los almacenamos en Eusol-C © en 4 °C y se transportaron para análisis morfológico. En Para evitar sesgos resultantes de las variaciones intercorneales, utilizamos ambas córneas pareadas de cada donante, una fue cortado con microqueratomo y el segundo con Láser de femtosegundo. Luego las muestras fueron analizadas por dos histólogos experimentados e independientes. Análisis SEM (microscopio electrónico de barrido) Seguimos el protocolo estándar de preparación de tejidos para Análisis por microscopía electrónica de barrido. Todas las muestras fueron prelavado en tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se fijó en glutaraldehído al 2,5% en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. temperatura (RT) y durante la noche a 4 ° C. Muestras fijas fueron lavados extensamente con tampón PBS