Jason Hooton, MD,1 Kyeong Hwan Kim, MD, PhD,1 Stephen I. Lentz, PhD,2 Nicholas Hicks, CEBT,3 Kayla Jones, CEBT,3 Kristen McCoy, CEBT,3 and Shahzad I. Mian, MD1 Corneal transplantation has changed significantly over the last two decades as sophisticated preparation and implantation techniques allow surgeons to selectively replace damaged or diseased corneal tissue with healthy donor grafts.1–4 Endothelial keratoplasty (EK) is the most commonly performed type of corneal transplant in the United States5 with 28,991 reported cases in 2017 including Descemet membrane endothelial keratoplasty (DMEK), the latest iteration in the evolution of EK with 7,628 cases. Recent publications provide increasing evidence that DMEK is not only safe but also provides superior visual outcomes with a more rapid rate of recovery of vision as compared to Descemet stripping automated endothelial keratoplasty (DSAEK).6–9 Graft rejection and rebubble rates are similar to DSAEK when performed by experienced surgeons, and patients subjectively prefer visual outcomes associated with DMEK when compared to DSAEK.7,8 These important advantages have led to increasing adoption of DMEK throughout the United States but concerns still linger about the difficulty of graft preparation and implantation.5,7 Historically, adoption of DSAEK increased as much of the tissue preparation was conducted by eye bank technicians prior to tissue arriving for surgery.10–12 DMEK has followed a similar trajectory and eye banks have pushed to provide better tissue with less surgeon dependent processing. Consequently, DMEK tissue is now commonly pre-stripped and pre-stamped. The next step which theoretically increases both efficiency in the OR and decreases the possibility of tissue damage prior to transplantation is preloading tissue.13 Although various methods exist for both processing and preloading tissue, efforts towards a universally standardized process continue.14,15 Concerns about the effect of this preloading on endothelial cell death is warranted but work done by our group and others has shown an acceptable level of cell loss with current procedures.16–19 Methods are also being refined which allow imaging to verify the quality of tissue after loading in delivery devices.17 The United States is one of a few countries in the world with a surplus of corneal tissue.5,20 Improved methods for delivering tissue worldwide could help international surgeons gain access to donor tissue and advanced processing. This could also further the goal of the eye banks to ensure proper stewardship of tissue gifts. The purpose of this study is to demonstrate the safety and viability of p3DMEK (pre-stripped, pre-stained, and pre-loaded) tissue being shipped nationally and internationally by comparing tissue processed the same day (control) as compared to tissue shipped and delivered 48 and 72 hours after processing, a timeframe needed to allow for international shipping. Corneal tissues and Shipping Protocol This study was performed using thirty-three donor corneas which were obtained and processed by the eye bank (Eversight, Ann Arbor, MI) according to standardized eye banking protocol including specular microscopy. Tissues, which were found to be unsuitable for surgical use but had normal endothelium, were included in this study. Exclusion criteria was tissue from donors with a history of diabetes, as is customary with DMEK tissue.21 Of these 33 tissues, 3 showed gross destruction due to unscrolling manipulation for the analysis and were also excluded. A total of 30 tissues were used for analysis in this study. The tissues were randomly divided into three groups by parallel assignment. Control group (less than 9 hours of storage) was comprised of tissue packed in a 24-hour cooler and delivered by automobile directly to the Kellogg Eye Center in Ann Arbor, MI the same days as they were prepared. For the long-term storage group 1 (48 hours storage), tissues were packed in a 24 hour cooler and shipped to the eye bank in Cleveland, OH via airfreight. The ice was replaced and the tissue was repacked in a new shipping box. It was then shipped back to the eye bank in Ann Arbor, MI for next day delivery. The tissue was then delivered by automobile to the Kellogg Eye Center. Long-term storage group 2 (72 hours storage) was comprised of tissues which were packed in a 24-hour cooler and shipped to the eye bank in Chicago, IL via FedEx by 10:30am. It was then repacked and shipped via FedEx for next day arrival at the eye bank in Cleveland, OH. Finally, the tissue was repacked a third time and shipped back to the eye bank in Ann Arbor, MI for next day delivery. The tissue was then delivered by automobile to the Kellogg Eye Center. All tissues were de-identified before delivery to the Kellogg Eye center (Ann Arbor, MI) and assigned groups were masked to the investigators. Corneal Tissue Preparation The donor corneas were prepared for p3DMEK by an experienced eye bank technician following the same protocol used for surgical tissue. Briefly, tying forceps were used to remove the cornea from the viewing chamber and position it endothelium side-up on the Barron Punch cutting block (Katena, Denville, NJ) where a 9.5 mm partial thickness trephination was performed. The endothelium was then stained with Trypan Blue 0.06% (DORC, Zuidland the Netherlands) for 60-90 seconds. The cornea well was filled with balanced salt solution (BSS, Alcon, Ft. Worth, TX) up to the limbus. The endothelial Descemet membrane (EDM) was then removed peripherally between the limbus and the trephinated lines using the tying forceps. The EDM was then circumferentially separated 360 degrees extending 0.5- 1.0 mm in from the trephinated line using one blade of the tying forceps. The EDM was linearly separated from the stroma limbus to limbus leaving 2mm of EDM adhered to the stroma for the hinge. Excess BSS was then wicked away while the graft rested on the sclera. A 2mm biopsy punch was used to cut through the stroma and epithelium. The 2mm plug was removed and the graft was returned to the stroma using BSS and fluid dynamics. The BSS was then removed using a surgical spear which allowed the graft to lay flat on the stroma. The hinge location was designated by drawing an arrow on the sclera. The vacuum was released and the cornea was inverted on the seating block. The graft was then dried through the 2mm biopsy hole. A micro s-stamp was inked and placed carefully on the stromal side of Descemet’s membrane through the 2mm biopsy hole. The 2mm plug was replaced and the center of the cornea was placed endothelium side up on the seating block without vacuum. The graft was then partially trephinated with a 7.5 mm punch and the peripheral EDM between the first and second trephination was removed. The tissue was positioned on the seating block with hinge at 6 o’clock. The cornea was filled with BSS and the graft was gently grasped at 12 o’clock and peeled towards 6 o’clock to completely remove the graft from the stroma. The graft was gently placed back in the corneal well and the BSS was removed with a surgical spear. Trypan Blue 0.06% was used to fill the corneal well and the graft was stained for 3 minutes. The Trypan Blue was then removed and replaced with Optisol-GS (Bausch and Lomb, Rochester, NY). Scrolling of the graft was encouraged with the addition of Optisol-GS as needed. The tissue was then carefully suctioned into a Straiko Modifed Jones Tube (Gunther Weiss Scientific Glass, Hillsboro, OR). A cap was placed at both ends of the tube. The capped Straiko Modified Jones tube was then placed into a labeled vial of Optisol-GS, and sealed. Endothelial Cell Staining Calcein AM dye (CAM, Catalog number C3100MP; Molecular Probes, Eugene, OR) was used to conduct endothelium cell viability staining as was previously described by Jardine et al.22 Briefly, a 50 μg aliquot of CAM was thawed and combined with 100 μL of dimethyl sulfoxide (Molecular Probes). This solution was then mixed with 20 ml of BSS to yield a final concentration of 2.5 μM CAM. Several drops of the CAM solution were placed onto the center of a glass-bottom 35 mm petri dish (MatTek Corp., Ashland, MA). An experienced DMEK surgeon (S.I.M.) injected the preloaded graft into the solution and the DMEK graft was unscrolled endothelial s Our data did not show a significant difference in ECL between control group and tissues that were shipped and stored for 48 or 72 hours. This provides additional evidence to the literature that DMEK tissue can safely be prepared and preloaded and then shipped to most locations in the United States and world. Any effort that facilitates tissue being utilized in the best possible way is of great value to the receiving patients and donor families as well. In 2017 the Eye Bank Association of America stated in their annual report that while domestic use of tissue has remained constant, international need has continued to rise.5 Until international tissue supply, infrastructure, and technical expertise are improved, there will continue to be an unmet growing demand for quality corneal tissue. Gain et al found that besides Sri Lanka, the United States is the only country with a surplus of tissue that is exporting donor corneas in meaningful numbers. They also estimate that only 1 cornea is currently available for every 70 needed worldwide.20 Our study takes into account two important variables when considering the use of preloaded tissue over long distances: storage time and the effect of shipping. Work done by Fent et al23 concluded that tissue could safely be precut and pre-stripped then stored for up to two days in cold-storage medium prior to tissue implantation without significant difference in primary failure rate, re-bubble rate or endothelial cell loss. Conversely, a retrospective study of 500 cases conducted by Rodríguez-Calvo de Mora and her colleagues at the Netherlands Institute for Innovative Ocular Surgery found a correlation between decrease in ECL at 6 months and the number of days the tissue spent in organ culture medium.24 A more comprehensive study was done by Romano et al25 which sought to compare the two most common preservation and preloading methods and their performance after storage and transportation. No significant difference was found in ECL between endothelium trifolded inward in organ culture in an IOL cartridge and endothelium rolled outwards in hypothermic conditions in a modified Jones tube. The tissues were transported for a total 20 hours and analyzed between 48 and 72 hours after preloading. The authors of this study concluded that while analysis of their data didn’t show statistical significance, there was a trend to toward superiority of the organ-culture stored method especially when combined with its longer shelf-life and less rigorous shipping temperature. Two additional papers recently published by Mark Terry’s group,17,18 using similar preloading methods to our own, demonstrated comparable ECL when tissue was preloaded and stored for 3 days (15.0 ± 3.0%) and when exposed to two shipping events over two days (18.5 ± 12.4%). Finally, much has been made of the difficult learning curve associated with successful DMEK and the preparation is often cited as one of the most technically challenging aspects. Preloaded tissue prepared by expert technicians provides one less variable to worry about for new or experienced surgeons. Experience with DSAEK has taught us that eliminating technically challenging barriers to transplantation will help further spur adoption of DMEK. Another important factor slowing widespread use of DMEK is the time in the operating room and its associated costs. Our unpublished data demonstrates a significant improvement in the operating room efficacy when preloaded tissue is used. Work done with DSAEK tissue supports the idea of cost saving with this increase in efficacy of graft preparation.26 Our study is somewhat limited by the need to unscroll and mount the tissue for processing. This can lead to overestimation of cell loss. An example of this was the exclusion of 3 tissues to due gross destruction of tissue when there was difficulty encountered when trying to unscroll the tissue. It has been recognized that younger tissue inherently leads to a tighter scroll of the graft,27 and this may have led to increased manipulation during preparation of the tissue for confocal imaging. Our data also showed a tendency that endothelial cells loss (%) was negatively correlated with the donor age (rho value = −0.35, −0.64, −0.32; P=0.32, 0.047, 0.37; in Control, Long-term storage group 1, and 2, respectively; Pearson’s correlation test). Moreover, although sustainability of stain was tracked and evaluated subjectively by rating as all or none in the present study, objective rating may provide more information about the feasibility of p3DMEK. Although the image analysis method incorporated in this study has been validated previously,19 direct measurement of endothelial cell count and function would provide additional information regarding potential effects of storage time on endothelial cells including the amount of change in endothelial cell count from the baseline at each time point. Additionally, given the time intensive nature of confocal imaging, 6 of the grafts were also imaged using widefield epi-fluorescence microscopy, which required about 1/20 the amount of time (Supplemental Figure S1). A comparison of ECL of confocal to widefield found a ratio of 1.1. While widefield microscopy provided faster acquisition, the XY (no Z) composite image underestimated the ECL due to the loss of clear signals present in the out of focus folds in the tissue. Further investigation will be required to provide statistically significant comparison between these two imaging methods. While ECL is an important indicator of future graft success, true clinical outcome data would be a better way to determine whether preloaded tissue can be safely transported over great distances. A clinical trial would be the next logical step in proving safety and efficacy of storing shipping p3DMEK for 72 hours. Further refinement of our current storage technique is being explored with the incorporation of a container to secure the modified Jones tube. It is the hope that these advances would make it possible for many patients to benefit from the advantages of DMEK. This study demonstrates that p3DMEK is a viable solution for surgeons in the United States and throughout the world with varying degrees of technical expertise and preparation experience. The benefits are obvious since it will decrease the likelihood of tissue being wasted and provide surgeons around the world access to the latest advances in corneal transplant technology. This will also help speed the adoption of DMEK as a primary means of EK by decreasing the burden and difficulty for surgeons. Precut, prestained tissue

Jason Hooton, MD,1 Kyeong Hwan Kim, MD, PhD,1 Stephen I. Lentz, PhD,2 Nicholas Hicks, CEBT,3 Kayla Jones, CEBT,3 Kristen McCoy, CEBT,3 y Shahzad I. Mian, MD1 El trasplante de córnea ha cambiado significativamente en las últimas dos décadas a medida que las técnicas sofisticadas de preparación e implantación permiten a los cirujanos reemplazar selectivamente el tejido corneal dañado o enfermo con injertos de donantes sanos.1–4 La queratoplastia endotelial (EK) es el tipo de trasplante de córnea que se realiza con más frecuencia en el mundo. Estados Unidos5 con 28.991 casos notificados en 2017, incluida la queratoplastia endotelial con membrana de Descemet (DMEK), la última iteración en la evolución de la EK con 7.628 casos.Publicaciones recientes proporcionan cada vez más evidencia de que DMEK no solo es segura sino que también proporciona resultados visuales superiores con una tasa de recuperación de la visión más rápida en comparación con la queratoplastia endotelial automatizada con extracción de Descemet (DSAEK).6–9 Las tasas de rechazo de injertos y reburbujas son similares a las de DSAEK cuando lo realizan cirujanos experimentados, y los pacientes subjetivamente prefieren los resultados visuales asociados con DMEK en comparación con DSAEK.7,8 Estas importantes ventajas han llevado a una creciente adopción de DMEK en todo Estados Unidos, pero aún persisten preocupaciones sobre la dificultad de la preparación e implantación del injerto.5,7 Históricamente, la adopción de DSAEK aumentó ya que gran parte de la preparación del tejido la realizaban técnicos de bancos de ojos antes de la cirugía. tejido que llega para cirugía.10–12 DMEK ha seguido una trayectoria similar y los bancos de ojos se han esforzado por proporcionar mejor tejido con un procesamiento menos dependiente del cirujano. En consecuencia, el tejido DMEK ahora comúnmente se pela y se estampa previamente.El siguiente paso que teóricamente aumenta la eficiencia en el quirófano y disminuye la posibilidad de daño tisular antes del trasplante es la precarga del tejido.13 Aunque existen varios métodos tanto para procesar como para precargar el tejido, continúan los esfuerzos hacia un proceso universalmente estandarizado.14,15 El efecto de esta precarga sobre la muerte de las células endoteliales está justificado, pero el trabajo realizado por nuestro grupo y otros ha demostrado un nivel aceptable de pérdida de células con los procedimientos actuales.16–19 También se están perfeccionando métodos que permiten obtener imágenes para verificar la calidad del tejido después de la carga. en dispositivos de administración.17 Estados Unidos es uno de los pocos países del mundo con un excedente de tejido corneal.5,20 Métodos mejorados para administrar tejido en todo el mundo podrían ayudar a los cirujanos internacionales a obtener acceso a tejido de donantes y procesamiento avanzado. Esto también podría promover el objetivo de los bancos de ojos de garantizar una gestión adecuada de las donaciones de pañuelos. El propósito de este estudio es demostrar la seguridad y viabilidad del tejido p3DMEK (predesmontado, preteñido y precargado) que se envía a nivel nacional e internacional comparando el tejido procesado el mismo día (control) con el tejido enviado y entregado 48 y 72 horas después del procesamiento, un plazo necesario para permitir el envío internacional.Tejidos corneales y protocolo de envío. Este estudio se realizó utilizando treinta y tres córneas de donantes que fueron obtenidas y procesadas por el banco de ojos (Eversight, Ann Arbor, MI) de acuerdo con un protocolo estandarizado de banco de ojos que incluye microscopía especular. En este estudio se incluyeron tejidos que no eran aptos para uso quirúrgico pero que tenían endotelio normal. El criterio de exclusión fue tejido de donantes con antecedentes de diabetes, como es habitual con el tejido DMEK.21 De estos 33 tejidos, 3 mostraron destrucción macroscópica debido a la manipulación del desenrollado para el análisis y también fueron excluidos. En este estudio se utilizaron un total de 30 tejidos para el análisis. Los tejidos se dividieron aleatoriamente en tres grupos mediante asignación paralela. El grupo de control (menos de 9 horas de almacenamiento) estaba compuesto por pañuelos de papel empaquetados en una hielera abierta las 24 horas y entregados por automóvil directamente al Kellogg Eye Center en Ann Arbor, MI, los mismos días en que fueron preparados. Para el grupo de almacenamiento a largo plazo 1 (almacenamiento de 48 horas), los pañuelos se empacaron en un refrigerador de 24 horas y se enviaron al banco de ojos en Cleveland, OH, por transporte aéreo. Se reemplazó el hielo y se volvió a empaquetar el pañuelo en una nueva caja de envío. Luego se envió de regreso al banco de ojos en Ann Arbor, MI para su entrega al día siguiente. Luego, el tejido fue entregado en automóvil al Kellogg Eye Center.El grupo 2 de almacenamiento a largo plazo (almacenamiento de 72 horas) estaba compuesto por pañuelos que se empaquetaron en una hielera de 24 horas y se enviaron al banco de ojos en Chicago, Illinois, a través de FedEx a las 10:30 a.m. Luego se volvió a empaquetar y se envió a través de FedEx para llegar al día siguiente al banco de ojos en Cleveland, OH. Finalmente, el tejido se volvió a empaquetar por tercera vez y se envió de regreso al banco de ojos en Ann Arbor, MI, para su entrega al día siguiente. Luego, el tejido fue entregado en automóvil al Kellogg Eye Center. Todos los tejidos fueron anonimizados antes de su entrega al Kellogg Eye Center (Ann Arbor, MI) y los grupos asignados fueron enmascarados para los investigadores. Preparación del tejido corneal Un técnico experimentado en bancos de ojos preparó las córneas de los donantes para p3DMEK siguiendo el mismo protocolo utilizado para el tejido quirúrgico. Brevemente, se utilizaron pinzas de atado para retirar la córnea de la cámara de visualización y colocarla con el lado del endotelio hacia arriba en el bloque de corte Barron Punch (Katena, Denville, Nueva Jersey) donde se realizó una trepanación de espesor parcial de 9,5 mm. Luego se tiñó el endotelio con azul tripán al 0,06 % (DORC, Zuidland, Países Bajos) durante 60 a 90 segundos. El pocillo de la córnea se llenó con solución salina equilibrada (BSS, Alcon, Ft. Worth, TX) hasta el limbo. Luego se eliminó periféricamente la membrana endotelial de Descemet (EDM) entre el limbo y las líneas trepanadas utilizando las pinzas de atado.Luego, el EDM se separó circunferencialmente 360 ​​grados extendiéndose de 0,5 a 1,0 mm desde la línea trepanada utilizando una hoja de las pinzas de atadura. El EDM se separó linealmente del estroma de limbo a limbo dejando 2 mm de EDM adheridos al estroma para la bisagra. Luego se eliminó el exceso de BSS mientras el injerto descansaba sobre la esclerótica. Se utilizó una punción de biopsia de 2 mm para cortar el estroma y el epitelio. Se retiró el tapón de 2 mm y el injerto se devolvió al estroma mediante BSS y dinámica de fluidos. Luego se extrajo el BSS utilizando una lanza quirúrgica que permitió que el injerto quedara plano sobre el estroma. La ubicación de la bisagra se designó dibujando una flecha en la esclerótica. Se liberó el vacío y se invirtió la córnea sobre el bloque de asiento. Luego se secó el injerto a través del orificio de biopsia de 2 mm. Se entintó un microsello y se colocó cuidadosamente en el lado estromal de la membrana de Descemet a través del orificio de biopsia de 2 mm. Se reemplazó el tapón de 2 mm y se colocó el centro de la córnea con el endotelio hacia arriba sobre el bloque de asiento sin vacío. Luego se trepanó parcialmente el injerto con un punzón de 7,5 mm y se eliminó el EDM periférico entre la primera y la segunda trepanación. El tejido se colocó sobre el bloque de asiento con bisagra a las 6 en punto. Se llenó la córnea con BSS y se sujetó suavemente el injerto a las 12 en punto y se despegó hacia las 6 en punto para retirar completamente el injerto del estroma.El injerto se volvió a colocar suavemente en el pozo corneal y se extrajo el BSS con una lanza quirúrgica. Se utilizó azul tripán al 0,06% para rellenar bien la córnea y se tiñó el injerto durante 3 minutos. Luego se eliminó el azul tripán y se reemplazó con Optisol-GS (Bausch and Lomb, Rochester, NY). Se fomentó el desplazamiento del injerto añadiendo Optisol-GS según fuera necesario. Luego, el tejido se succionó cuidadosamente en un tubo Straiko Modifed Jones (Gunther Weiss Scientific Glass, Hillsboro, OR). Se colocó una tapa en ambos extremos del tubo. Luego se colocó el tubo Straiko Modified Jones tapado en un vial etiquetado de Optisol-GS y se selló. Tinción de células endoteliales Se usó tinte calceína AM (CAM, número de catálogo C3100MP; Molecular Probes, Eugene, OR) para realizar la tinción de viabilidad de las células endoteliales como lo describieron previamente Jardine et al.22 Brevemente, se descongeló una alícuota de 50 μg de CAM y se combinó con 100 μl. de dimetilsulfóxido (Molecular Probes). Luego, esta solución se mezcló con 20 ml de BSS para producir una concentración final de CAM 2,5 µM. Se colocaron varias gotas de la solución CAM en el centro de una placa de Petri de 35 mm con fondo de vidrio (MatTek Corp., Ashland, MA).Un cirujano DMEK experimentado (S.I.M.) inyectó el injerto precargado en la solución y el injerto DMEK se desenrolló endotelialmente. Nuestros datos no mostraron una diferencia significativa en la ECL entre el grupo de control y los tejidos que se enviaron y almacenaron durante 48 o 72 horas. Esto proporciona evidencia adicional a la literatura de que el tejido DMEK se puede preparar y precargar de manera segura y luego enviar a la mayoría de los lugares de los Estados Unidos y el mundo. Cualquier esfuerzo que facilite que el tejido se utilice de la mejor manera posible es de gran valor tanto para los pacientes receptores como para las familias de los donantes. En 2017, la Eye Bank Association of America declaró en su informe anual que, si bien el uso nacional de tejido se ha mantenido constante, la necesidad internacional ha seguido aumentando.5 Hasta que mejoren el suministro internacional de tejido, la infraestructura y la experiencia técnica, seguirá habiendo una creciente demanda insatisfecha de tejido corneal de calidad. Gain et al descubrieron que, además de Sri Lanka, Estados Unidos es el único país con un excedente de tejido que exporta córneas de donantes en cantidades significativas. También estiman que actualmente sólo hay 1 córnea disponible por cada 70 que se necesitan en todo el mundo.20 Nuestro estudio tiene en cuenta dos variables importantes al considerar el uso de tejido precargado en largas distancias: el tiempo de almacenamiento y el efecto del envío.El trabajo realizado por Fent et al23 concluyó que el tejido se podía precortar y pelar de manera segura y luego almacenarlo durante hasta dos días en un medio de almacenamiento en frío antes de la implantación del tejido sin diferencias significativas en la tasa de falla primaria, la tasa de reburbujas o la pérdida de células endoteliales. Por el contrario, un estudio retrospectivo de 500 casos realizado por Rodríguez-Calvo de Mora y sus colegas en el Instituto Holandés de Cirugía Ocular Innovadora encontró una correlación entre la disminución de la ECL a los 6 meses y el número de días que el tejido pasó en medio de cultivo de órganos.24 Romano et al25 realizaron un estudio más completo que buscaba comparar los dos métodos de conservación y precarga más comunes y su desempeño después del almacenamiento y transporte. No se encontraron diferencias significativas en la ECL entre el endotelio triplicado hacia adentro en cultivo de órganos en un cartucho de LIO y el endotelio enrollado hacia afuera en condiciones hipotérmicas en un tubo Jones modificado. Los tejidos fueron transportados durante un total de 20 horas y analizados entre 48 y 72 horas después de la precarga. Los autores de este estudio concluyeron que, si bien el análisis de sus datos no mostró significación estadística, había una tendencia hacia la superioridad del método almacenado de cultivo de órganos, especialmente cuando se combina con su vida útil más larga y una temperatura de envío menos rigurosa.Dos artículos adicionales publicados recientemente por el grupo de Mark Terry,17,18, que utilizaron métodos de precarga similares a los nuestros, demostraron ECL comparable cuando el tejido se precargó y almacenó durante 3 días (15,0 ± 3,0%) y cuando se expuso a dos eventos de envío durante dos días ( 18,5 ± 12,4%). Finalmente, se ha hablado mucho de la difícil curva de aprendizaje asociada con el éxito de DMEK y la preparación a menudo se cita como uno de los aspectos técnicamente más desafiantes. El tejido precargado preparado por técnicos expertos proporciona una variable menos de la que preocuparse para los cirujanos nuevos o experimentados. La experiencia con DSAEK nos ha enseñado que eliminar las barreras técnicamente desafiantes para los trasplantes ayudará a estimular aún más la adopción de DMEK. Otro factor importante que frena el uso generalizado de DMEK es el tiempo en el quirófano y sus costos asociados. Nuestros datos no publicados demuestran una mejora significativa en la eficacia del quirófano cuando se utiliza tejido precargado. El trabajo realizado con tejido DSAEK apoya la idea de ahorro de costes con este aumento en la eficacia de la preparación del injerto26. Nuestro estudio está algo limitado por la necesidad de desenrollar y montar el tejido para su procesamiento. Esto puede llevar a una sobreestimación de la pérdida de células. Un ejemplo de esto fue la exclusión de 3 tejidos debido a una destrucción grave del tejido cuando se encontró dificultad al intentar desenrollarlo.Se ha reconocido que el tejido más joven conduce inherentemente a un desplazamiento más apretado del injerto,27 y esto puede haber llevado a una mayor manipulación durante la preparación del tejido para la obtención de imágenes confocales. Nuestros datos también mostraron una tendencia a que la pérdida de células endoteliales (%) se correlacionara negativamente con la edad del donante (valor rho = −0,35, −0,64, −0,32; P = 0,32, 0,047, 0,37; en control, grupo 1 de almacenamiento a largo plazo y 2, respectivamente; prueba de correlación de Pearson). Además, aunque en el presente estudio se rastreó y evaluó subjetivamente la sostenibilidad de la tinción clasificándola como todo o nada, la calificación objetiva puede proporcionar más información sobre la viabilidad de p3DMEK. Aunque el método de análisis de imágenes incorporado en este estudio ha sido validado previamente,19 la medición directa del recuento y la función de las células endoteliales proporcionaría información adicional sobre los efectos potenciales del tiempo de almacenamiento en las células endoteliales, incluida la cantidad de cambio en el recuento de células endoteliales desde el valor inicial en cada punto de tiempo. Además, dada la naturaleza intensiva en tiempo de las imágenes confocales, también se tomaron imágenes de 6 de los injertos utilizando microscopía de epifluorescencia de campo amplio, lo que requirió aproximadamente 1/20 de la cantidad de tiempo (Figura complementaria S1). Una comparación de la ECL de campo confocal a campo amplio encontró una proporción de 1,1.Si bien la microscopía de campo amplio proporcionó una adquisición más rápida, la imagen compuesta XY (sin Z) subestimó la ECL debido a la pérdida de señales claras presentes en los pliegues desenfocados del tejido. Se necesitarán más investigaciones para proporcionar una comparación estadísticamente significativa entre estos dos métodos de imágenes. Si bien la ECL es un indicador importante del éxito futuro del injerto, los datos verdaderos de los resultados clínicos serían una mejor manera de determinar si el tejido precargado se puede transportar de forma segura a grandes distancias. Un ensayo clínico sería el siguiente paso lógico para demostrar la seguridad y eficacia del almacenamiento de p3DMEK durante 72 horas. Se está explorando un mayor refinamiento de nuestra técnica de almacenamiento actual con la incorporación de un contenedor para asegurar el tubo Jones modificado. Se espera que estos avances hagan posible que muchos pacientes se beneficien de las ventajas de DMEK. Este estudio demuestra que p3DMEK es una solución viable para cirujanos en los Estados Unidos y en todo el mundo con diversos grados de experiencia técnica y experiencia en preparación. Los beneficios son obvios, ya que disminuirá la probabilidad de que se desperdicie tejido y brindará a los cirujanos de todo el mundo acceso a los últimos avances en tecnología de trasplante de córnea. Esto también ayudará a acelerar la adopción de DMEK como medio principal de EK al disminuir la carga y la dificultad para los cirujanos. Tejido precortado y teñido