Eye-bank Preparation of Endothelial Tissue Grace E. Boynton, B.A.1 and Maria A. Woodward, M.D.1 In 1998, Dr. Melles re-introduced a technique to selectively replace the posterior cornea via endothelial keratoplasty (EK) [1] resulting in great enthusiasm for EK. In 2006, when eye banks began supplying precut corneal tissues for EK, the number of corneas prepared for penetrating keratoplasty (PKP) began to decline, and corneas utilized for EK dramatically increased. In 2012, the Eye Bank Association of America reported that 68,681 corneas were distributed for keratoplasty [2] using U.S. supplied tissue, of which 24,277 (35%) were for EK, representing a 4.2% increase from 2011 and a 38.9% increase from 2008 [2]. EK has become the treatment of choice for corneal endothelial dysfunction. Donor corneas for EK can be prepared by surgeons or pre-dissected by eye-bank personnel. Studies examining eye-bank preparation report low tissue-processing failure rates and excellent quality [3] with comparable endothelial cell loss, visual outcomes, and detachment rates between eye-bank and surgeon-prepared tissue [4]. Fungal and bacterial contamination rates and clinical infection rates [5] appear no higher for eye-bank prepared EK tissue than for PKP [5,6] and for anterior lamellar keratoplasty [6]. Eye- bank preparation of tissues increases operating room efficiency, minimizes tissue wastage, and allows for the preoperative measurement of graft thickness and endothelial cell density (ECD). The current and evolving techniques for eye-bank tissue preparation for EK are reviewed here. Descemet Stripping Endothelial Keratoplasty (DSAEK) DSAEK is the most commonly performed type of EK providing reduced visual recovery time and minimizing astigmatism compared to PKP. However, many patients fail to achieve 20/20 vision. Many factors contribute to visual outcomes following DSAEK, including presence of a stromal interface, and surgeons debate techniques to prepare optimal donor lenticules. DSAEK tissue is most often prepared with a microkeratome. The donor corneoscleral rim is mounted on an artificial anterior chamber (ACC), and microkeratome cutting depth is adjusted to control the thickness of the resulting posterior lenticule [7]. Graft thickness asymmetry and irregularity can lead to a postoperative hyperopic refractive shift [8–10] and studies have demonstrated that microkeratome-prepared DSAEK corneas are nonuniform, non-concentric, and non-circular [11*]. Thinner lenticules can be obtained by using slower microkeratome passes, but graft asymmetry is more difficult to control [12]. Researchers investigated smoothing tissue with an excimer laser after the microkeratome pass. Cleary et al. demonstrated reduced stromal roughness, improved contour, and reduced thickness asymmetry without endothelial cell damage after excimer laser smoothing passes [13]. However, the clinical significance of these findings has not yet been established. Femtosecond preparation of DSAEK tissue has been explored in hopes of making lenticules more precise and uniform. Compared to microkeratome-prepared tissues there is greater irregularity of the posterior corneal surface, rougher stromal beds, and increased thickness irregularity in femto-prepared tissues [14, 15]. No difference was noted in endothelial cell density and viability between the two techniques [15]. Both Vetter et al. and Mootha et al. suggest that irregular stromal dissections may occur because the femtosecond laser applanation cone compresses and deforms the donor cornea [16]. One study suggested that optimized laser settings could improve the surface quality of femtosecond-prepared tissues making them equitable to microkeratome-prepared grafts [17]. Double-pass microkeratome techniques to yield ‘ultrathin’ DSAEK lenticules are another area of active research. The definition of ‘ultrathin’ tissue is variable, with most studies using ≤100μm but some studies using ≤130μm in thickness. The double-pass technique produces thinner grafts [18–20], but some studies report high perforation rates [20] and increased endothelial cell damage [18]. Sikder et al. observed that larger microkeratome head sizes led to greater variation in final graft thickness [20]. To decrease corneal perforation risk, Busin et al. hydrated grafts after the initial microkeratome cut, by intrastromal injections of balanced salt solution (BSS) or by immersing tissue in hypo-osmotic tissue culture medium for 24 hours [19]. Both strategies thickened the residual tissue bed and prevented perforations during the second microkeratome pass. However, the BSS injections resulted in multiple areas of Descemet detachment, making this hydration technique impractical for clinical use. Ultrathin tissue can be prepared using a low-pulse energy, high- frequency femtosecond laser [21]. There was no increased endothelial cell damage with this technique, but the resulting stromal surface appeared irregular. The authors of the study suggest that stromal bed quality can be improved with modified laser settings. Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) In DMEK, the transplanted lenticule includes only Descemet membrane (DM) and the corneal endothelium. In contrast to DSAEK, no stroma-to-stroma interface exists with DMEK. Retrospective studies have shown that DMEK provides quicker visual recovery and improved visual acuity compared to DSAEK [22]. DMEK has not been widely accepted because of the challenges associated with preparing and handling the delicate graft tissue. DMEK graft preparation strategies are not as standardized as DSAEK graft preparation techniques. Several harvesting strategies for DMEK donor preparation have been described. Melles et al. described a manual peeling method where a donor corneoscleral rim is immersed in BSS and the DM is peeled with 1-point fine non-toothed forceps [23–25]. A 4–7% endothelial cell loss rate was reported using this technique [23]. Giebel and Price subsequently described the SCUBA (submerged corneas using backgrounds away) technique, where a cornea is submerged in Optisol or BSS during harvesting to minimize surface tension; this allows the DM to settle back onto the stroma [26, 27]. Studies using the SCUBA technique had a 4.2% [28] to 8% [26] rate of unsuccessful graft preparation. The methods described by Melles and Lie and by Giebel and Price are similar, but have some specific differences reviewed in a previous article [29]. To better distribute tension, Kruse et al. used a second pair of forceps during peeling with a reported 1% graft loss rate [30]. Using the same technique, Schlötzer- Schrehardt et al. obtained uncomplicated and complete peeling in 96% of corneas and successful grafts with isolated tears in 2% of grafts [31*]. They found that 2% of corneas had extremely strong adhesions, created by ultrastructural peg-like interlockings or increased adhesive glycoproteins along the DM-stromal interface, preventing successful graft preparation [31*]. Yoeruek et al. proposed using a curvilinear forceps with a half-moon shaped non- toothed anterior segment to equally distribute the force needed for DM separation [32]. This technique decreased preparation time and resulted in lower endothelial cell death. Sikder et al. evaluated using a microkeratome to remove a majority of the donor stroma, followed by a Barraquer sweep to dissect the residual stroma from the DM [33]. There was minimal endothelial cell loss, but anterior segment optical coherence tomography (AS-OCT) revealed residual corneal stroma following preparation. Pneumatic dissection is another technique utilized for DMEK graft preparation. First described by Anwar and Teichmann for anterior lamellar keratoplasty, air is injected into the cornea to create a dissection plane between the donor stroma and DM [34]; this technique has since been applied for DMEK graft preparation. Venzano et al. described the use of an artificial anterior chamber (AAC) in the Anwar air-bubble technique to harvest the Descemet-endothelium complex [35]. They recommended trypan blue-staining of the endothelium to visualize needle positioning and pressure reduction in the AAC prior to air injection to facilitate big bubble formation with a success rate of 89%. Additionally, they reported a low endothelial cell loss (15%) when the bubble was immediately deflated after DM separation, but high endothelial cell loss (83%) when the bubble remained inflated. Zarei-Ghanavati et al. used a reverse big-bubble technique and reported that pneumatic dissection had greater success in older donors with high endothelial cell counts [36]. Busin et al. modified the pneumatic dissection technique to include a superficial keratectomy prior to air injection and reported a 5% preparation failure rate with 4% endothelial cell loss [37]. To add structural support and facilitate tissue handling with the pneumatic dissection technique, Studeny et al. described “DMEK with a stromal rim” (DMEK-S) [38]. In this technique, the central graft consists of only DM and endothelium, while an additional layer of posterior stroma is maintained in the periphery. The tissue loss rate fell to 5% with experience performing the technique. However, other studies evaluating the DMEK-S technique report a 23% tissue loss rate due to big bubble rupture and failure of big bubble formation [39]. Yoeruek et al. compared DMEK preparation using air dissection and single-forceps direct peeling and found that air dissection reduced the time to prepare the graft [40]. There were no significant differences between the two techniques in terms of endothelial cell loss or rate of apoptosis, and they reported that both techniques produced stroma- free grafts. However, other studies evaluated the pneumatic dissection technique and observed, through histological analysis, that there was residual stroma in all grafts [41, 42]. In 2013, Muraine et al. [43**] reported a technique in which the cornea is mounted on an AAC and a 330° superficial trephination is performed. A cannula is inserted under the resulting flap and BSS is injected to detach the DM. They reported an endothelial cell loss of 4% after three days in storage. All tissue preparations for research were successful and grafts were stroma-free. Among corneas prepared for clinical use, there was a 4% failure rate. Tissue Quality Tissue quality can be assessed through the impact of donor tissue characteristics on endothelial keratoplasty complications such as graft failure and dislocation. In particular, recent research has evaluated tissue storage times, methods for assessing ECD and tissue thickness, tissue transportation, and strategies for storing and marking tissue. ECD is an important consideration in determining donor tissue quality because it influences long-term corneal graft survival. A preoperative donor ECD of 2000 cell/mm2 was determined as the lower limit for adequate PKP graft survival [44, 45], but a safe minimum ECD value for EK has not been validated in the literature. Using specular microscopy, no associations have been found between preoperative donor ECD and donor dislocation or 1-year postoperative ECD after DSAEK [46]. In fact, standard eye-bank methods for determining ECD, either with specular microscopy for cold stored tissues or with transmitted light microscopy for organ cultured tissues, overestimate the actual pool of viable endothelial cells [47]. Pipparelli et al. presented a method to determine the viable endothelial cell pool by triple labeling with Hoeschst/ethidium homodimer/calcein-AM and performing image analysis of the whole graft surface [47]. By comparing the viable endothelial cell pool with the ECD determined by standard counting methods, they found that current protocols overestimate the viable endothelial cell pool in predissected EK grafts by 20%. Saad et al. also described the limitations of specular microscopy in determining ECD and developed an alternative method for ECD estimation [48]. Their method combines vital dye staining of endothelial cells with quantitative image analysis using Adobe Photoshop software. Future studies that assess viable ECD may be helpful in determining a safe minimum preoperative donor ECD for EK. The safety of extending graft storage times is being investigated, as longer storage times would allow for an expansion of the corneal donor pool. Terry et al. performed a retrospective analysis on 362 eyes undergoing DSAEK and found no correlation between death-to-surgery time and endothelial cell loss at any postoperative time point [49]. In 2013, Ruzza et al. demonstrated that DSAEK donor tissue could be precut, trephined, and then stored in organ culture as a ready-to-use lenticule for up to 14 days without causing endothelial damage or tissue thickening [50]. A prospective multicenter National Eye Institute study, the Cornea Preservation Time Study is currently underway [51]. This study will track 3-year graft failure rates following DSAEK and compare outcomes of tissues stored 8–14 days with those stored 7 days or fewer. Recent studies have reported on techniques for marking and storing donor lenticules. Gentian violet (GV) can be used to mark DSAEK donor stroma to facilitate appropriate tissue orientation in the anterior chamber. However, markings can persist at the graft- host interface [52], and there are case reports of GV causing significant corneal edema after DSAEK [53]. Using an in vitro model, Ide et al. demonstrated that GV markings on the donor stroma damage the corneal endothelium [54]. Accordingly, researchers developed marking strategies with smaller peripheral GV markings [55]. Stoeger et al. hypothesized that isopropyl alcohol in markers was causing endothelial damage [56]. They proposed applying GV ink to a Moria “S” stamp and then allowing the ink to dry before applying the stamp to the donor stroma. With this technique, there was no significant difference in endothelial damage between marked and unmarked corneas. Researchers have also evaluated the impact of culture conditions on visual outcomes in EK. Laaser et al. compared tissue storage in short-term culture (Optisol-GS; Bausch & Lamb) at 4C and organ culture (Dulbecco Modified Eagle Medium [Biochrom]; CorneaMax Medium [Eurobio]) at 34C and looked at outcomes following DMEK [57]. There were no differences in best-corrected visual acuity, postoperative ECD, or central corneal thickness between the two groups. However, more air injections were necessary in the short-term culture group to obtain graft adherence. Methods for measuring EK donor tissue thickness have also been evaluated. Ultrasound pachymetry (USP) is the most commonly used method to assess donor tissue thickness, but AS-OCT has been investigated as it does not require corneal contact. Tang et al. found that predictability of microkeratome cut depth was significantly worse with AS-OCT measurements than with USP [58]. However, another study by Fante et al. found that AS-OCT measurements of central corneal thickness in precut EK donor tissues were not significantly different from USP measurements [59]. Tang et al. evaluated DSAEK graft deturgescence following the microkeratome cut to determine the optimal time for graft thickness measurement [60]. Their study found that the thickness of precut tissue stabilizes around 2 hours after microkeratome cut. Studies have also investigated tissue transportation. Ide et al. observed significant endothelial cell damage in DSAEK lenticules that were transported in Optisol GS without the anterior lamellar corneal tissue (ALCT) cap [61]. Interestingly, Jhanji et al. later observed that when DSAEK lenticules were stored in organ culture, there was no increase in endothelial cell damage in lenticules that had been stored without overlying ALCT cap [62]. Global shortages in the corneal donor pool have also prompted researchers to evaluate the safety of transporting precut DSAEK lenticules for use overseas. Yamazoe et al. retrospectively reviewed 124 DSAEK tissues that had been transported overseas to Japan and found that all received tissues used had an ECD >2000 cells/mm2 before surgery [63*]. They argued that with overseas transport and precutting, one can maintain acceptable graft quality. Go to: Conclusion Surgical techniques for endothelial keratoplasty and tissue preparation methods evolve as we attempt to optimize clinical outcomes of transplant patients. The process of corneal tissue transplantation starts with a donor’s gift of sight and a recipient’s need for a new cornea. The numerous steps in the process to result in successful transplantation with excellent visual outcomes are influenced by the research done in the field of eye- banking. This article highlights current preparation techniques, refinement of each technique, and ongoing research in this area. Many corneal transplant recipients will directly benefit from the dedicated work devoted to optimizing endothelial keratoplasty.

Preparación del banco de ojos de tejido endotelial Grace E. Boynton, B.A.1 y Maria A. Woodward, M.D.1 En 1998, el Dr. Melles reintrodujo una técnica para reemplazar selectivamente la córnea posterior mediante queratoplastia endotelial (EK) [1], lo que generó un gran entusiasmo por la EK. En 2006, cuando los bancos de ojos comenzaron a suministrar tejidos corneales precortados para la EK, el número de córneas preparadas para la queratoplastia penetrante (PKP) comenzó a disminuir y las córneas utilizadas para la EK aumentaron dramáticamente. En 2012, la Eye Bank Association of America informó que se distribuyeron 68.681 córneas para queratoplastia [2] utilizando tejido suministrado en EE. UU., de las cuales 24.277 (35%) fueron para EK, lo que representa un aumento del 4,2% con respecto a 2011 y un aumento del 38,9% con respecto a 2008. [2]. La EK se ha convertido en el tratamiento de elección para la disfunción endotelial corneal. Las córneas de los donantes para EK pueden ser preparadas por cirujanos o diseccionadas previamente por el personal del banco de ojos. Los estudios que examinan la preparación del banco de ojos informan bajas tasas de falla en el procesamiento de tejidos y excelente calidad [3] con pérdida de células endoteliales, resultados visuales y tasas de desprendimiento comparables entre el tejido del banco de ojos y el tejido preparado por el cirujano [4]. Las tasas de contaminación fúngica y bacteriana y las tasas de infección clínica [5] no parecen ser más altas para el tejido EK preparado en el banco de ojos que para la PKP [5,6] y para la queratoplastia lamelar anterior [6].La preparación de tejidos en el banco de ojos aumenta la eficiencia del quirófano, minimiza el desperdicio de tejido y permite la medición preoperatoria del grosor del injerto y la densidad de células endoteliales (ECD). Aquí se revisan las técnicas actuales y en evolución para la preparación de tejidos del banco de ojos para EK. Queratoplastia endotelial de extracción de Descemet (DSAEK) DSAEK es el tipo de EK que se realiza con más frecuencia, ya que proporciona un tiempo de recuperación visual reducido y minimiza el astigmatismo en comparación con la PKP. Sin embargo, muchos pacientes no logran alcanzar una visión 20/20. Muchos factores contribuyen a los resultados visuales después de DSAEK, incluida la presencia de una interfaz estromal, y los cirujanos debaten técnicas para preparar lentículas donantes óptimas. El tejido DSAEK se prepara con mayor frecuencia con un microquerátomo. El borde corneoescleral del donante se monta en una cámara anterior artificial (ACC) y la profundidad de corte del microqueratomo se ajusta para controlar el grosor del lentículo posterior resultante [7]. La asimetría y la irregularidad del grosor del injerto pueden provocar un desplazamiento refractivo hipermetrópico posoperatorio [8-10] y los estudios han demostrado que las córneas DSAEK preparadas con microqueratoma no son uniformes, no concéntricas y no circulares [11*]. Se pueden obtener lentículas más delgadas utilizando pases de microquerátomo más lentos, pero la asimetría del injerto es más difícil de controlar [12]. Los investigadores estudiaron el alisado del tejido con un láser excimer después del paso del microquerátomo. Cleary et al.demostraron una rugosidad estromal reducida, un contorno mejorado y una asimetría de espesor reducida sin daño a las células endoteliales después de los pases de alisado con láser excimer [13]. Sin embargo, aún no se ha establecido la importancia clínica de estos hallazgos. Se ha explorado la preparación con femtosegundos de tejido DSAEK con la esperanza de hacer lentículas más precisas y uniformes. En comparación con los tejidos preparados con microqueratoma, hay una mayor irregularidad en la superficie corneal posterior, lechos estromales más rugosos y una mayor irregularidad en el espesor en los tejidos preparados con femto [14, 15]. No se observaron diferencias en la densidad y viabilidad de las células endoteliales entre las dos técnicas [15]. Tanto Vetter et al. y Mootha et al. sugieren que pueden ocurrir disecciones estromales irregulares porque el cono de aplanación del láser de femtosegundo comprime y deforma la córnea del donante [16]. Un estudio sugirió que la configuración optimizada del láser podría mejorar la calidad de la superficie de los tejidos preparados con femtosegundos, haciéndolos equivalentes a los injertos preparados con microquerátomos [17]. Las técnicas de microquerátomo de doble paso para producir lentículas DSAEK "ultrafinas" son otra área de investigación activa. La definición de tejido "ultrafino" es variable: la mayoría de los estudios utilizan ≤100 μm, pero algunos estudios utilizan ≤130 μm de espesor.La técnica de doble paso produce injertos más delgados [18-20], pero algunos estudios informan altas tasas de perforación [20] y un mayor daño de las células endoteliales [18]. Sikder et al. observaron que tamaños de cabeza de microqueratomo más grandes conducían a una mayor variación en el espesor final del injerto [20]. Para disminuir el riesgo de perforación corneal, Busin et al. injertos hidratados después del corte inicial del microquerátomo, mediante inyecciones intraestromales de solución salina equilibrada (BSS) o sumergiendo el tejido en un medio de cultivo de tejido hipoosmótico durante 24 horas [19]. Ambas estrategias engrosaron el lecho de tejido residual y evitaron perforaciones durante el segundo pase del microquerátomo. Sin embargo, las inyecciones de BSS dieron como resultado múltiples áreas de desprendimiento de Descemet, lo que hizo que esta técnica de hidratación no fuera práctica para uso clínico. Se puede preparar tejido ultrafino utilizando un láser de femtosegundo de alta frecuencia y baja energía de pulso [21]. No hubo un aumento del daño de las células endoteliales con esta técnica, pero la superficie estromal resultante parecía irregular. Los autores del estudio sugieren que la calidad del lecho estromal se puede mejorar modificando la configuración del láser. Queratoplastia endotelial con membrana de Descemet (DMEK) En DMEK, el lentículo trasplantado incluye únicamente la membrana de Descemet (DM) y el endotelio corneal. A diferencia de DSAEK, con DMEK no existe una interfaz estroma a estroma.Estudios retrospectivos han demostrado que DMEK proporciona una recuperación visual más rápida y una mejor agudeza visual en comparación con DSAEK [22]. DMEK no ha sido ampliamente aceptada debido a los desafíos asociados con la preparación y manipulación del delicado tejido del injerto. Las estrategias de preparación de injertos DMEK no están tan estandarizadas como las técnicas de preparación de injertos DSAEK. Se han descrito varias estrategias de recolección para la preparación de donantes DMEK. Melles et al. describieron un método de pelado manual en el que se sumerge un borde corneoescleral donante en BSS y el DM se pela con unas pinzas finas sin dientes de 1 punta [23-25]. Con esta técnica se informó una tasa de pérdida de células endoteliales del 4 al 7% [23]. Giebel y Price describieron posteriormente la técnica SCUBA (córneas sumergidas sin fondos), en la que se sumerge una córnea en Optisol o BSS durante la extracción para minimizar la tensión superficial; esto permite que el DM vuelva a asentarse en el estroma [26, 27]. Los estudios que utilizaron la técnica SCUBA tuvieron una tasa de preparación fallida del injerto del 4,2% [28] al 8% [26]. Los métodos descritos por Melles y Lie y por Giebel y Price son similares, pero tienen algunas diferencias específicas revisadas en un artículo anterior [29]. Para distribuir mejor la tensión, Kruse et al. utilizó un segundo par de fórceps durante el pelado y se informó una tasa de pérdida del injerto del 1% [30]. Utilizando la misma técnica, Schlötzer-Schrehardt et al.obtuvieron un pelado completo y sin complicaciones en el 96% de las córneas e injertos exitosos con desgarros aislados en el 2% de los injertos [31*]. Descubrieron que el 2% de las córneas tenían adherencias extremadamente fuertes, creadas por entrelazamientos ultraestructurales en forma de clavijas o un aumento de glicoproteínas adhesivas a lo largo de la interfaz DM-estroma, lo que impedía una preparación exitosa del injerto [31*]. Yoeruek et al. propusieron utilizar unas pinzas curvilíneas con un segmento anterior no dentado en forma de media luna para distribuir equitativamente la fuerza necesaria para la separación de DM [32]. Esta técnica disminuyó el tiempo de preparación y resultó en una menor muerte de células endoteliales. Sikder et al. evaluado utilizando un microqueratomo para eliminar la mayor parte del estroma donante, seguido de un barrido Barraquer para diseccionar el estroma residual del DM [33]. Hubo una pérdida mínima de células endoteliales, pero la tomografía de coherencia óptica del segmento anterior (AS-OCT) reveló estroma corneal residual después de la preparación. La disección neumática es otra técnica utilizada para la preparación del injerto DMEK. Descrito por primera vez por Anwar y Teichmann para la queratoplastia laminar anterior, se inyecta aire en la córnea para crear un plano de disección entre el estroma donante y la DM [34]; Desde entonces, esta técnica se ha aplicado para la preparación del injerto DMEK. Venzano et al. describieron el uso de una cámara anterior artificial (CAA) en la técnica de burbuja de aire de Anwar para recolectar el complejo de endotelio de Descemet [35].Recomendaron la tinción con azul tripano del endotelio para visualizar la posición de la aguja y la reducción de la presión en el AAC antes de la inyección de aire para facilitar la formación de grandes burbujas con una tasa de éxito del 89%. Además, informaron una baja pérdida de células endoteliales (15%) cuando la burbuja se desinfló inmediatamente después de la separación de DM, pero una alta pérdida de células endoteliales (83%) cuando la burbuja permaneció inflada. Zarei-Ghanavati et al. utilizaron una técnica inversa de burbuja grande e informaron que la disección neumática tuvo mayor éxito en donantes de mayor edad con recuentos elevados de células endoteliales [36]. Busin et al. modificó la técnica de disección neumática para incluir una queratectomía superficial antes de la inyección de aire e informó una tasa de fracaso de la preparación del 5% con una pérdida de células endoteliales del 4% [37]. Para agregar soporte estructural y facilitar el manejo del tejido con la técnica de disección neumática, Studeny et al. describió "DMEK con borde estromal" (DMEK-S) [38]. En esta técnica, el injerto central consta únicamente de DM y endotelio, mientras que en la periferia se mantiene una capa adicional de estroma posterior. La tasa de pérdida de tejido cayó al 5% con experiencia en la realización de la técnica. Sin embargo, otros estudios que evalúan la técnica DMEK-S informan una tasa de pérdida de tejido del 23% debido a la ruptura de burbujas grandes y al fracaso en la formación de burbujas grandes [39]. Yoeruek et al.compararon la preparación de DMEK utilizando disección con aire y pelado directo con una sola pinza y encontraron que la disección con aire reducía el tiempo para preparar el injerto [40]. No hubo diferencias significativas entre las dos técnicas en términos de pérdida de células endoteliales o tasa de apoptosis, e informaron que ambas técnicas produjeron injertos sin estroma. Sin embargo, otros estudios evaluaron la técnica de disección neumática y observaron, mediante análisis histológico, que existía estroma residual en todos los injertos [41, 42]. En 2013, Muraine et al. [43**] informaron una técnica en la que la córnea se monta sobre un AAC y se realiza una trepanación superficial de 330°. Se inserta una cánula debajo del colgajo resultante y se inyecta BSS para separar el DM. Informaron de una pérdida de células endoteliales del 4% después de tres días de almacenamiento. Todas las preparaciones de tejido para la investigación fueron exitosas y los injertos estaban libres de estroma. Entre las córneas preparadas para uso clínico, hubo una tasa de fracaso del 4%. Calidad del tejido La calidad del tejido se puede evaluar a través del impacto de las características del tejido del donante en las complicaciones de la queratoplastia endotelial, como el fracaso del injerto y la dislocación. En particular, investigaciones recientes han evaluado los tiempos de almacenamiento de tejido, los métodos para evaluar la ECD y el grosor del tejido, el transporte de tejido y las estrategias para almacenar y marcar tejido.La ECD es una consideración importante para determinar la calidad del tejido del donante porque influye en la supervivencia del injerto de córnea a largo plazo. Se determinó que una DCE preoperatoria del donante de 2000 células/mm2 era el límite inferior para una supervivencia adecuada del injerto PKP [44, 45], pero en la literatura no se ha validado un valor mínimo seguro de DCE para EK. Utilizando microscopía especular, no se han encontrado asociaciones entre el DCE del donante preoperatorio y la dislocación del donante o el DCE postoperatorio de 1 año después de DSAEK [46]. De hecho, los métodos estándar de banco de ojos para determinar la DCE, ya sea con microscopía especular para tejidos almacenados en frío o con microscopía de luz transmitida para tejidos cultivados de órganos, sobreestiman el conjunto real de células endoteliales viables [47]. Pipparelli et al. presentó un método para determinar el conjunto de células endoteliales viables mediante triple marcaje con Hoeschst/homodímero de etidio/calceína-AM y realizando análisis de imágenes de toda la superficie del injerto [47]. Al comparar el conjunto de células endoteliales viables con la ECD determinada mediante métodos de recuento estándar, descubrieron que los protocolos actuales sobreestiman en un 20% el conjunto de células endoteliales viables en injertos de EK prediseccionados. Saad et al. También describió las limitaciones de la microscopía especular para determinar la ECD y desarrolló un método alternativo para la estimación de la ECD [48]. Su método combina la tinción con tinte vital de células endoteliales con el análisis cuantitativo de imágenes utilizando el software Adobe Photoshop.Los estudios futuros que evalúen el DCE viable pueden ser útiles para determinar un DCE preoperatorio mínimo seguro del donante para EK. Se está investigando la seguridad de extender los tiempos de almacenamiento de los injertos, ya que tiempos de almacenamiento más prolongados permitirían una expansión del grupo de donantes de córnea. Terry y col. realizó un análisis retrospectivo en 362 ojos sometidos a DSAEK y no encontró correlación entre el tiempo desde la muerte hasta la cirugía y la pérdida de células endoteliales en ningún momento posoperatorio [49]. En 2013, Ruzza et al. demostraron que el tejido donado por DSAEK podía precortarse, trepanarse y luego almacenarse en cultivo de órganos como una lentícula lista para usar durante hasta 14 días sin causar daño endotelial o engrosamiento del tejido [50]. Actualmente se está llevando a cabo un estudio prospectivo multicéntrico del Instituto Nacional del Ojo, el Estudio del tiempo de conservación de la córnea [51]. Este estudio rastreará las tasas de fracaso del injerto a 3 años después de DSAEK y comparará los resultados de los tejidos almacenados entre 8 y 14 días con los almacenados durante 7 días o menos. Estudios recientes han informado sobre técnicas para marcar y almacenar lentículas de donantes. Se puede utilizar violeta de genciana (GV) para marcar el estroma del donante DSAEK para facilitar la orientación adecuada del tejido en la cámara anterior. Sin embargo, las marcas pueden persistir en la interfaz injerto-huésped [52], y hay informes de casos de GV que causa edema corneal significativo después de DSAEK [53]. Utilizando un modelo in vitro, Ide et al. demostró que las marcas GV en el estroma del donante dañan el endotelio corneal [54].En consecuencia, los investigadores desarrollaron estrategias de marcado con marcas GV periféricas más pequeñas [55]. Stoeger y cols. Plantearon la hipótesis de que el alcohol isopropílico en los marcadores estaba causando daño endotelial [56]. Propusieron aplicar tinta GV a un sello Moria “S” y luego dejar que la tinta se seque antes de aplicar el sello al estroma donante. Con esta técnica, no hubo diferencias significativas en el daño endotelial entre las córneas marcadas y no marcadas. Los investigadores también han evaluado el impacto de las condiciones de cultivo en los resultados visuales en EK. Laaser et al. compararon el almacenamiento de tejido en cultivo a corto plazo (Optisol-GS; Bausch & Lamb) a 4 °C y cultivo de órganos (medio Eagle modificado por Dulbecco [Biochrom]; medio CorneaMax [Eurobio]) a 34 °C y observaron los resultados después de DMEK [57]. No hubo diferencias en la agudeza visual mejor corregida, el ECD postoperatorio o el grosor corneal central entre los dos grupos. Sin embargo, fueron necesarias más inyecciones de aire en el grupo de cultivo a corto plazo para obtener la adherencia del injerto. También se han evaluado métodos para medir el espesor del tejido del donante EK. La paquimetría ultrasónica (USP) es el método más utilizado para evaluar el espesor del tejido del donante, pero se ha investigado la AS-OCT porque no requiere contacto corneal. Tang y cols. encontraron que la previsibilidad de la profundidad de corte del microqueratomo era significativamente peor con las mediciones AS-OCT que con USP [58]. Sin embargo, otro estudio de Fante et al.encontraron que las mediciones AS-OCT del espesor corneal central en tejidos de donantes EK precortados no eran significativamente diferentes de las mediciones USP [59]. Tang y cols. evaluaron la deturgescencia del injerto DSAEK después del corte del microqueratomo para determinar el momento óptimo para medir el espesor del injerto [60]. Su estudio encontró que el grosor del tejido precortado se estabiliza alrededor de 2 horas después del corte del microqueratomo. Los estudios también han investigado el transporte de tejidos. Idé et al. observaron un daño significativo en las células endoteliales en lentículas DSAEK que fueron transportadas en Optisol GS sin la tapa de tejido corneal laminar anterior (ALCT) [61]. Curiosamente, Jhanji et al. Posteriormente observaron que cuando las lentículas DSAEK se almacenaban en cultivo de órganos, no había ningún aumento en el daño de las células endoteliales en las lentículas que se habían almacenado sin una tapa ALCT superpuesta [62]. La escasez mundial de donantes de córnea también ha llevado a los investigadores a evaluar la seguridad del transporte de lentículas DSAEK precortadas para su uso en el extranjero. Yamazoe et al. Revisaron retrospectivamente 124 tejidos DSAEK que habían sido transportados al extranjero a Japón y encontraron que todos los tejidos recibidos utilizados tenían una ECD >2000 células/mm2 antes de la cirugía [63*]. Argumentaron que con el transporte y el precorte al extranjero se puede mantener una calidad aceptable del injerto.Ir a: Conclusión Las técnicas quirúrgicas para la queratoplastia endotelial y los métodos de preparación de tejidos evolucionan a medida que intentamos optimizar los resultados clínicos de los pacientes trasplantados. El proceso de trasplante de tejido corneal comienza con la visión del donante y la necesidad del receptor de una nueva córnea. Los numerosos pasos del proceso para lograr un trasplante exitoso con excelentes resultados visuales están influenciados por la investigación realizada en el campo de los bancos de ojos. Este artículo destaca las técnicas de preparación actuales, el refinamiento de cada técnica y la investigación en curso en esta área. Muchos receptores de trasplantes de córnea se beneficiarán directamente del trabajo dedicado a optimizar la queratoplastia endotelial.